| 重鏈抗體（heavy-chain antibody）是一種在駝?lì)惡蛙浌囚~類動(dòng)物血清中大量存在的天然抗體,。與常規(guī)抗體不同,，重鏈抗體僅由重鏈組成,，其抗原結(jié)合域稱為納米抗體（nanobody）,。納米抗體具有體積小（直徑2.5nm,，長(zhǎng)4nm,， ~15 kDa）,；免疫原性弱,；可溶性高,、耐受性強(qiáng)；組織滲透性強(qiáng),；表達(dá)高效,、純化簡(jiǎn)單；改造容易等優(yōu)勢(shì),。且其CDR3環(huán)很長(zhǎng),，更有利于結(jié)合裂縫或空腔，這些獨(dú)特的性質(zhì)使納米抗體成為下一代治療性抗體,。2019年FDA批準(zhǔn)了首個(gè)納米抗體藥物caplacizumab,，用于治療獲得性血栓性血小板減少性紫癜（acquired thrombotic thrombocytopenic purpura, aTTP）。
目前,，噬菌體展示是從免疫聚焦（immune-focused）或合成（synthetic）納米抗體庫(kù)中分離目標(biāo)結(jié)合納米抗體的最常用技術(shù),。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中構(gòu)建類似的系統(tǒng)可能有助于針對(duì)包括G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor, GPCR）在內(nèi)的跨膜蛋白實(shí)現(xiàn)生理狀態(tài)下的功能篩選。然而經(jīng)過質(zhì)粒構(gòu)建,、轉(zhuǎn)化、提�,�,；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、慢病毒庫(kù)包裝,；感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞等系列操作后,，最終展示于細(xì)胞表面的納米抗體庫(kù)豐度大幅降低（納米抗體庫(kù)豐度在以上步驟中不斷丟失）。因此,，急需開發(fā)一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中構(gòu)建高豐度納米抗體庫(kù)的新方法,。
針對(duì)以上問題，本課題組致力于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中構(gòu)建高豐度納米抗體庫(kù),。首先通過PCR將互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determining region, CDR）隨機(jī)序列引入到上游和下游dsDNA,。在此基礎(chǔ)上，課題組開發(fā)了兩種納米抗體庫(kù)構(gòu)建方法（圖1）,。第一種方法稱為dsDNA-HR,，將含有50-bp相同重疊序列的上,、下游dsDNA共轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞系HEK293T中，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)同源重組（homologous recombination, HR）,，形成完整的納米抗體庫(kù)表達(dá)模塊,。第二種方法稱為in vitro ligation，通過連接限制性內(nèi)切酶消化的上,、下游dsDNA,，獲得了全長(zhǎng)dsDNA并轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)納米抗體庫(kù)。高通量測(cè)序結(jié)果顯示,，這兩種方法均產(chǎn)生了超過100萬個(gè)獨(dú)特的納米抗體序列,。
圖1. dsDNA-HR (A)和in vitro ligation (B)納米抗體庫(kù)構(gòu)建策略示意圖
上述工作近期以標(biāo)題“Construction of Synthetic Nanobody Library in Mammalian Cells by dsDNA-Based Strategies”發(fā)表在ChemBioChem。論文第一作者為天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院研究生趙雁杰,，論文通訊作者為天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院李帥副研究員,，研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金（NO. 31870860，31971388）支持,。
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